答：

1、鹽分殘留過多。注意Buffer WA和Buffer WBR的洗滌順序，確保按正確的順序洗滌純化柱。

2、乙醇?xì)埩暨^多。注意高速空離步驟不可省略，并且空離后的核酸純化柱應(yīng)小心取出，避免倒置，以免使2 ml離心管管底的殘留濾液接觸到核酸純化柱。

3、使用了過多的RNA用作反轉(zhuǎn)錄模板。通常20 μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入100~1000 ng RNA作為模板比較適宜。注意cDNA作為PCR模板時需要適當(dāng)稀釋，以免殘留的反轉(zhuǎn)錄酶（包括已經(jīng)失活的反轉(zhuǎn)錄酶）干擾Taq酶的活性。

4、反轉(zhuǎn)錄后的DNA-RNA復(fù)合體對熒光PCR的影響。建議減少隨機(jī)引物的用量或用特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，或者在反轉(zhuǎn)錄后添加RNase H進(jìn)行處理，去除DNA-RNA復(fù)合體。