近段時間，小新在做熒光探針檢測實驗時，陰性對照經(jīng)常起線，也就是我們常說的“陰性抬頭”現(xiàn)象。

經(jīng)過總結(jié)發(fā)現(xiàn)有個規(guī)律：陰性對照起線的CT值都很大，并且也不是每次實驗陰性對照都會起線。

于是開始懷疑是環(huán)境中有擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，但是我們的PCR實驗室是嚴(yán)格按照三區(qū)隔離要求建設(shè)的，實驗操作也都是按照要求進(jìn)行操作的，為什么還會有污染？這個污染究竟是從何而來的呢？

仔細(xì)回想了一下，之前小新由于好奇心，在某一次熒光擴(kuò)增完成之后，將擴(kuò)增產(chǎn)物拿去電泳了，難道就是由此在環(huán)境中形成了氣溶膠污染？

雖然電泳室也有專門的負(fù)壓通風(fēng)系統(tǒng)，也遠(yuǎn)離PCR實驗室，但是電泳室隔壁的DNA實驗室是開放式的，人員流動量大，氣溶膠還是有可能從DNA實驗室通過人員流動帶入PCR實驗室的。

為了驗證這個猜想是否正確，小新設(shè)計了一個實驗方法，接下來就讓我們看看到底是不是這個原因造成的污染吧。

一、實驗?zāi)康?/span>

驗證陰性對照中的污染源來源。

二、實驗材料

2×Probe qPCR Mix（Simgen Cat.No.7206100，Lot No.：20230229）

臺式小量離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415D）

旋渦振蕩器(杭州米歐儀器有限公司XH-C)

電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）

超微量分光光度計（Simgen Cat.No.Sim-100）

超微量電子天平（福州華科電子儀器有限公司TP-213）

電泳儀（北京六一儀器廠DYY-6C型）

熒光PCR儀（ABI PRISM®7500）

三、實驗方法

1. 對照組：讓生產(chǎn)技術(shù)員在遠(yuǎn)離PCR實驗室的陰性生產(chǎn)車間用新開封的2×Probe qPCR Mix、引物、探針，按照下表配置熒光PCR反應(yīng)體系（不添加模板DNA），共8管。

2. 測試組：小新在DNA實驗室同時用同一批次新開封的2×Probe qPCR Mix、引物、探針，按照下表配置熒光PCR反應(yīng)體系（不添加模板DNA），共8管。

3. 在ABI PRISM®7500熒光PCR儀中進(jìn)行熒光定量PCR。實驗參數(shù)如下：

Stage 1： 預(yù)變性（Reps：1）

95℃  30秒

Stage 2： PCR反應(yīng)（Reps：40）

95℃  10秒

60℃  30秒

四、實驗結(jié)果

熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果如下圖：

五、實驗結(jié)論

1. 從圖中可以得知對照組的8個樣本均未起線，說明新拆封的試劑、以及陰性生產(chǎn)車間都是沒有污染源的。而測試組的8個樣本中除了2個樣本未起線外，其余6個樣本均起線了，更重要的是這6個起線樣本中有2個樣本的CT值都接近34了，而原來在PCR室配制的陰性PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增出現(xiàn)的陽性CT值無一例外都是大于35的。現(xiàn)在基本上可以判定DNA實驗室就是環(huán)境中污染源的源頭了，當(dāng)然DNA實驗室的污染又來自隔壁的電泳室。

2. 這次實驗讓我們見識了氣溶膠的厲害，竟然在我們專業(yè)的PCR實驗都碰到氣溶膠的污染！所以說，PCR檢測的超高靈敏度是把雙刃劍，要應(yīng)用這一技術(shù)的超高靈敏度，就必須注意實驗過程中的每一個可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物污染的環(huán)節(jié)。為此，我們實驗室立即啟動了下述幾項應(yīng)急的糾正預(yù)防措施：

1） DNA實驗室開窗、開門通風(fēng)，持續(xù)兩周時間以上。

2） 下班時間PCR實驗室、DNA實驗室用紫外線照射，持續(xù)一周時間。

3） 暫停相關(guān)檢測實驗，除陰性車間拆封過的試劑外，其他相關(guān)的檢測試劑全部丟棄。

4） 熒光PCR檢測后的產(chǎn)物原則上不允許開蓋電泳檢測。如果有需求，則要求在電泳結(jié)束后及時開啟紫外燈變性可能存在環(huán)境中的氣溶膠，同時更換電泳緩沖液，然后還須將擴(kuò)增產(chǎn)物、凝膠、吸頭單獨用自封袋密封后再丟棄。

5） 嚴(yán)格遵循在不同實驗室工作需要更換不同工作服的規(guī)定。

3. 熒光PCR檢測理論上能檢測到1個DNA分子，所以同學(xué)們請牢記一點，如無必要請千萬不要開蓋、不要開蓋、不要開蓋?。?！----重要的事情說三遍。否則一旦發(fā)現(xiàn)實驗環(huán)境出現(xiàn)氣溶膠污染了，就需要更換試劑，紫外線照射，實驗室通風(fēng)，非常之麻煩，即便有專用的電泳室，也不要輕易嘗試。