RNA,即核糖核酸,是存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類(lèi)病毒中的遺傳信息載體,在遺傳表達(dá)與調(diào)控研究、疾病研究和物種鑒定等分子生物學(xué)領(lǐng)域都有著重要應(yīng)用。
RNA與DNA不同,是單鏈結(jié)構(gòu),本身就不穩(wěn)定,再加上它的天敵——RNA酶(RNase)廣泛存在于自然界中,又非常穩(wěn)定,用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。因此,RNA非常容易降解,在提取中必須做好相應(yīng)的保護(hù)措施。而在提取之后,為了確認(rèn)RNA提取是否成功,一般我們都會(huì)進(jìn)行電泳觀察,這時(shí)候同樣需要注意,如果操作不當(dāng),那么得到的電泳圖可能就會(huì)不盡如人意。下面就給大家介紹一些RNA電泳常見(jiàn)的情況。
看了這么多RNA電泳圖,那么如何來(lái)做好RNA電泳呢?經(jīng)典的RNA電泳用的是甲醛瓊脂糖凝膠電泳,利用甲醛與谷氨酸殘基的單亞氨基基團(tuán)形成不穩(wěn)定的堿基配對(duì),這些配對(duì)通過(guò)阻止鏈內(nèi)堿基配對(duì)而使RNA維持在變性狀態(tài),不會(huì)被RNase降解。但是近些年報(bào)導(dǎo)的甲醛中毒事件令人談“醛”色變,在2017年10月27日,世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單中,甲醛更是被列入了一類(lèi)致癌物中。因此很多人不愿意使用甲醛瓊脂糖凝膠電泳。
那么不使用甲醛瓊脂糖凝膠電泳方法,如何做好RNA電泳呢?今天小新就將實(shí)驗(yàn)室用的RNA電泳方法分享給大家作參考。
1. 將電泳槽、制膠槽、梳子等用0.1%的DEPC水37℃浸泡過(guò)夜,然后用RNase-free的水沖洗干凈;
2. 用RNase-free的水配置1×TAE,制膠和電泳液也要使用RNase-free的水配置的1×TAE:
3. 向電泳液中加入0.05%的蛋白酶K貯存液(Simgen Cat.No.8000224),混合均勻,靜置過(guò)夜(16~24小時(shí),由于蛋白酶K最適活性在60℃左右,夏天可適當(dāng)縮短,冬天可適當(dāng)延長(zhǎng)),第二天即可進(jìn)行RNA電泳。
解釋?zhuān)?/span>RNase不管如何穩(wěn)定,本質(zhì)還是蛋白質(zhì),而蛋白酶K就是專(zhuān)門(mén)分解蛋白質(zhì)的,用上述方法進(jìn)行RNA電泳,既能保證RNA在電泳過(guò)程中不會(huì)被降解,又無(wú)毒無(wú)害,能夠放心使用。希望這個(gè)方法對(duì)各位讀者有所幫助,能夠做好RNA電泳實(shí)驗(yàn)。