最近實驗室接到一個客戶的投訴，說是購買的DL2000 DNA Ladder有問題，跑電泳時出現(xiàn)DNA降解的情況。由于Simgen的DNA Marker含有DNA穩(wěn)定劑，曾經(jīng)在室溫條件下做過放置一年的真實穩(wěn)定性測試，都未觀察到DNA降解的現(xiàn)象，所以對于客戶的投訴感到非常疑惑。但是為了慎重起見，我們還是從庫存產(chǎn)品中抽了一支相同批次的DL2000 DNA Ladder進行了電泳實驗，結果顯示條帶正常，并未出現(xiàn)降解情況。

既然不是產(chǎn)品本身的問題，那么就有可能是電泳過程中出現(xiàn)的問題。Simgen實驗室經(jīng)過探索，最后我們猜測可能已經(jīng)找到了問題的癥結所在，結合之前有一篇詳細介紹如何制作一張漂亮的瓊脂糖凝膠電泳圖的文章，今天再給大家介紹一個非常容易被忽略的因素——核酸染料的用量。

一、實驗材料：

DL2000 DNA Ladder（Simgen Cat.No.MD1006）

瓊脂糖（BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10）

50×TAE（Simgen Cat.No.9001500）

溴化乙錠（EB）（Simgen Cat.No.9026001）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

二、實驗步驟：

1. 取10 ml 50×TAE，加入490 ml去離子水，混合均勻，稀釋成1×TAE。

2. 用瓊脂糖，1×TAE制作兩塊相同濃度（1%）的凝膠，一塊加入正常用量的溴化乙錠（終濃度0.5 μg/ml），一塊加入過量的溴化乙錠（終濃度3 μg/ml）。

3. 分別在兩塊凝膠中依次加入1.5 μl、5 μl、10 μl DL2000 DNA Ladder，放入同一電泳槽進行電泳。

4. 每隔一段時間取出凝膠，觀察并記錄條帶情況。

三、實驗結果：

    電泳圖如下，圖一電泳了10分鐘，圖二電泳了15分鐘，圖三電泳了20分鐘，圖四是電泳25分鐘的條帶情況，每張圖的左側部分是正常溴化乙錠用量的凝膠，右側部分是過量溴化乙錠用量的凝膠。

1. 從圖一來看，兩塊凝膠跑出來的條帶情況差不多，都很模糊，這是因為電泳時間太短，條帶沒能完全分開，擠成一團顯得很糊，這再次驗證了電泳時間的重要性。

2. 圖二顯示，左側條帶開始有分散開的趨勢，而右側條帶除了最上方的那條，其余條帶仍舊擠成一團，模糊不清。

3. 從圖三、圖四可以看出，左側的DL2000 DNA Ladder條帶均已分開，帶型清晰，而右側的DL2000 DNA Ladder下方條帶仍舊十分模糊，類似拖尾的狀態(tài)，和降解情況很是相像。仔細看的話，還能夠發(fā)現(xiàn)加的DNA量越多，條帶越糊。

4.仔細對比圖一到圖五，可以發(fā)現(xiàn)，客戶投訴說Marker有降解情況的條帶（圖五）與圖一和圖二中溴化乙錠過量導致的條帶情況很是類似，均是最上面的條帶分開了，下面的其他條帶擠在一起，模糊不清。

四、討論與分析

1. 我們通過實驗證明了：溴化乙錠用量過多會導致電泳的條帶變模糊，出現(xiàn)類似拖尾的情況。

2. 關于溴化乙錠會影響DNA條帶的泳動速度，早有前輩們已經(jīng)提到過了——有一種精確標定DNA分子量的電泳方法是這樣要求的：制作一塊不含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠，電泳結束后再將凝膠放入含溴化乙錠（0.5 μg/ml）的電泳緩沖液中浸泡30—45分鐘，待溴化乙錠分子嵌入DNA分子后再在紫外燈下觀察。（分子克隆實驗指南 精編版P.158）

3. 從深層次分析原因，我們猜測可能性如下：核酸是帶負電的，而溴化乙錠中能嵌入DNA雙鏈中的基團是帶正電的（溴離子不參與染色），電泳過程中兩者的運動方向剛好相反，當溴化乙錠量過多的情況下，對核酸的反向作用力就顯現(xiàn)出來了：通過給核酸向正極的泳動施加一個阻力，使得核酸的移動變得困難，相同長度的條帶的核酸泳動速度變得混亂，最終使整個條帶因此變寬了，如果多個條帶黏連在一起就形成了類似降解的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象隨著核酸上樣量的增加，會變得越發(fā)明顯。

因此，溴化乙錠等類似的核酸染料使用過程中一定要控制好用量（注意Gelred或者Gelgreen核酸染料更要注意控制用量，因為Gelred是由兩個溴化乙錠分子拼接起來，而Gelgreen則是由兩個SYBR Green分子拼接起來的，顯色靈敏度或許更高了，但嵌入核酸分子中后的阻力也更大了），按說明書上的標準用量使用，切忌太過隨意。