前段時間，小編做感受態(tài)細胞檢測總是效果不佳，不得已逐一排查影響因素。原來只是想看看質粒DNA是不是有降解的現象，結果出乎意料地發(fā)現了一個驚人的結果：質粒DNA不但沒降解，反過來似乎連在一起，分子量變大了？！

先描述下實驗測試的方法：

一、實驗準備：

質粒樣本：新鮮抽提的pUC-19以及-20℃冰箱里存放并且多次使用的pUC-19。

實驗材料：1%的瓊脂糖凝膠、1.5ml離心管、EcoR I內切酶。

實驗設備：臺式小量離心機、電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱、微量紫外分光光度計、移液器等。

二、實驗內容：

1、取20μl新鮮提取的pUC-19以及冰箱存放的pUC-19，分別配制EcoR I酶切體系置于37℃培養(yǎng)箱中酶切2h；

2、在1%的瓊脂糖凝膠上，依次加入質粒DNA或相應質粒DNA的酶切產物，分別在電泳進行15min、30min、45min后在紫外燈下觀察結果并拍照。

三、實驗結果：

為了更清晰地描述，小編特意做了一張模擬圖，如下，

 可能很多人都聽說經典的質粒DNA三條帶的理論：“共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）： 質粒的兩條鏈沒有斷裂，超螺旋結構；開環(huán)DNA（ocDNA）： 質粒的一條鏈斷裂，松弛的環(huán)狀分子；線形DNA（lDNA）： 質粒的兩條鏈均斷裂，線性分子”。

 按照上述理論，C是超螺旋結構；A是一條鏈斷裂，松弛的環(huán)狀分子； B是線性分子（B在單酶切的位置）。但是松弛的環(huán)狀質粒DNA為什么比線性質粒DNA跑得慢呢？既然超螺旋結構因為穿過瓊脂糖凝膠的阻力最小，跑得最快，那A（松弛的環(huán)狀分子）應該跑第二位??？

再有：位置A一開始總是與B重合的，以至于我們平時總是下意識地將它認作是線性質粒。然而，當電泳時間足夠長時，它會與B位置分隔開，并且在新鮮提取的質粒（含量較少）、存放過久的質粒及其酶切產物中都會出現。而且在冰箱凍存過的質粒體系中占有很大的比重（電泳條帶寬度及亮度）。這A到底什么鬼？

請教領導，結果領導反對經典的三條帶理論，明確地表示：C位置為我們常見的超螺旋結構的質粒，B位置為pUC19酶切后的線性質粒，A是兩個超螺旋結構的質粒DNA聚合在一起了，簡稱質粒二聚體。質粒二聚體理論上是正在復制的過程中的質粒被提取出來了，所以分子量是超螺旋結構的一倍。

聽上去還是領導的理論更合理，那問題來了：為什么質粒在冰箱里凍存一段時間后超螺旋結構大量地轉變成了二聚體結構呢？。結果領導兩手一攤，不知道。最后他說，實際上A是二聚體也只是看上去更合理的一種理論而已，不排除其他的可能性。你可去大膽地去猜測形成二聚體質粒（或者是松弛環(huán)狀分子）的各種原因，重要的是用實驗去驗證你的理論。

于是小編開始了天馬行空的臆想：

1. 第一個嫌疑是反復凍融--在分子生物學實驗中，經常會看到一句話“切忌反復凍融”，會不會是因為凍融過程中形成的冰晶對質粒DNA產生了損傷，才導致質粒DNA電泳的帶型產生變化的？如果質粒DNA損傷的理論是正確的，似乎A是松弛環(huán)狀分子更合理，唯一的矛盾是A酶切不能被完全切開，很難解釋。

2. 如果是反復凍融先損傷質粒DNA--比如產生了部分單鏈DNA，再由于質粒之間有大量共同序列，或許部分單鏈DNA之間就互補配對上了，結果就生成了A(質粒二聚體)。這樣似乎也解釋了為什么有一部分A（質粒二聚體）酶切切不開：如果酶切位點剛好包含在二聚體的鉸鏈中（包括在酶切位點附近），估計限制性內切酶就無能為力了。

3. 除了反復凍融，還有什么因素會損傷DNA呢？染菌!質粒DNA并不是在無菌環(huán)境下提取的，有微生物在質粒DNA中就難說了，會不會是微生物產生的酶類促使質粒部分解旋成單鏈并與其它質粒纏繞在一起從而形成二聚體呢？——至少這個猜測比較容易設計實驗驗證。

4. 或許是DNA溶液中殘留的二價陽離子是罪魁禍首……DNA分子不是帶負電的嗎，二價陽離子左手右手各拉一個質粒DNA，二聚體就產生了……

當然，以上影響因素都是小編的主觀猜測，并不能確定是誰是導致質粒結構變化的罪魁禍首，如果您也有類似的發(fā)現，并且還用實驗測試驗證過，歡迎告知我們：technical@simgen.cn

回到轉化實驗，既然質粒DNA在電泳能呈現那么多不同的帶型，那么不同帶型的質粒對轉化效率有什么影響呢？請繼續(xù)關注我們下一期的核酸技術探索。