一、材料：

1. 樣品：送檢腿骨組織樣本由客戶提供。

2. 動(dòng)物組織DNA試劑盒（Simgen，Cat.No.3101050）

3. PCR擴(kuò)增試劑、引物、探針為杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司自配或委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

4. PCR儀：ABI PRISM® 7500 Sequence DeteCtion System

5. 離心機(jī)：Thermo Biofuge pico

二、方法：

1. 用Simgen動(dòng)物組織DNA試劑盒分離純化樣本中的DNA。

2. 按下列組分配制PCR檢測試劑( 40 μl反應(yīng)體系)：

Master Mix(2×)              20.0 μl

上游引物FP                1.0 μl

下游引物RP                1.0 μl

探針Probe                  0.5 μl

50× ROX                   0.8μl

ddH₂O                     11.7 μl

向每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入35 μl反應(yīng)混合液，再加入5μl分離純化的DNA進(jìn)行qPCR檢測。

注：陽性對(duì)照用實(shí)驗(yàn)室保藏的驢肉DNA作為模板，陰性對(duì)照用ddH₂O作為模板。

3. PCR循環(huán)條件設(shè)置： 95℃ 1 min→40×（95℃ 15s→60℃ 30s）

三、結(jié)果判定：

1．有效性原則

陰性對(duì)照：無FAM熒光信號(hào)檢出，未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

陽性對(duì)照：有FAM熒光信號(hào)檢出，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

以上要求必須同時(shí)滿足，否則本次檢測無效。

結(jié)果：

1. 送檢樣本中的腿骨組織DNA通過驢的特異性熒光探針擴(kuò)增檢測呈陽性，判斷檢測腿骨確為驢腿骨。

2. 結(jié)果分析：

本次腿骨組織樣本提取了兩管DNA，分別是腿骨上殘留的肌肉組織（編號(hào)為donkey 1）和腿骨內(nèi)的骨髓組織（編號(hào)為donkey 2），經(jīng)PCR擴(kuò)增均為陽性，Ct值分別為19.621和19.664，陽性對(duì)照的Ct值為17.408，陰性對(duì)照未起線。

送檢腿骨組織樣本的Ct值報(bào)告：

送檢腿骨組織DNA樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線：

 A：陰性對(duì)照 B：donkey1 C：donkey2 D：陽性對(duì)照